Deep sequencing of small RNAs reveals the repertoire of miRNAs and piRNAs in Biomphalaria glabrata

BACKGROUND Biomphalaria glabrata snails are widely distributed in schistosomiasis endemic areas like America and Caribe, displaying high susceptibility to infection by Schistosoma mansoni. After the availability of B. glabrata genome and transcriptome data, studies focusing on genetic markers and small non-coding RNAs have become more relevant. The small RNAs have been considered important through their ability to finely regulate the gene expression in several organisms, thus controlling the functions like cell growth, metabolism, and susceptibility/resistance to infection. OBJECTIVE The present study aims on identification and characterisation of the repertoire of small non-coding RNAs in B. glabrata (Bgl-small RNAs). METHODS By using small RNA sequencing, bioinformatics tools and quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (RT-qPCR), we identified, characterised, and validated the presence of small RNAs in B. glabrata. FINDINGS 89 mature miRNAs were identified and five of them were classified as Mollusk-specific. When compared to model organisms, sequences of B. glabrata miRNAs showed a high degree of conservation. In addition, several target genes were predicted for all the mature miRNAs identified. Furthermore, piRNAs were identified in the genome of B. glabrata for the first time. The B. glabrata piRNAs showed strong conservation of uridine as first nucleotide at 5' end, besides adenine at 10th position. Our results showed that B. glabrata has diverse repertoire of circulating ncRNAs, several which might be involved in mollusk susceptibility to infection, due to their potential roles in the regulation of S. mansoni development. MAIN CONCLUSIONS Further studies are necessary in order to confirm the role of the Bgl-small RNAs in the parasite/host relationship thus opening new perspectives on interference of small RNAs in the organism development and susceptibility to infection.

Aspectos adaptativos de Schistosoma mansoni na fase esquistossômulo: abordagem in vivo e in vitro

Dentre as formas evolutivas do Schistosoma mansoni, o esquistossômulo é uma das mais estudadas para desenvolvimento de novos fármacos e sistemas diagnósticos. Embora a transformação in vitro seja vantajosa, é importante discutir as limitações do uso de resultados obtidos a partir de parasitos cultivados in vitro em relação aos obtidos no processo natural de infecção. No presente trabalho, esquistossômulos obtidos in vivo e in vitro foram comparados em relação a capacidade de captar sondas fluorescentes, específicas para estruturas internas celulares ou membranas superficiais do parasito. As sondas empregadas para membranas e estruturas internas mostraram marcação similar entre parasitos obtidos in vitro, por transformação mecânica (Mec) e por penetração em pele (Pel). No entanto, diferenças foram observadas quando estes parasitos foram comparados a outros obtidos in vivo pelo método de Clegg (Clegg et al,1965), sendo detectado um aumento da permeabilidade de membranas.

Os dados sugerem que nos esquistossômulos cultivados in vivo o metabolismo é mais ativo nas células superficiais e que durante sua permanência por até 72 horas na pele há um extenso turnover da superfície do parasito, envolvendo moléculas internas e uma umento da liberação de imunógenos. A aumentada permeabilidade pode permitir ainda a captação de moléculas, capazes de estimular o crescimento do parasito. Além disso, bibliotecas de esquistossômulos Mec cultivados em soro portal (SPO3h eSPO12h) e soro periférico de hamster (SPE3h, SPE12h) foram comparadas utilizando sequenciamento de nova geração (NGS) e análise da expressão de genes específicos. Após o sequenciamento e análise dos genes expressos uma alta similaridade entre as réplicas foi encontrada. Comparando as amostras SPO3h versus SPO12h 58 transcritos se mostraram diferencialmente expressos. De acordo com as anotações de termos de ontologia gênica (GO) os genes diferencialmente expressos após 12 horas de contato com o soro portal de hamster, estão ligados a processos importantes ao desenvolvimento até vermes adultos. Assim, este estudo viabilizou um maior entendimento de mecanismos de controle sobre a internalização de moléculas pelo parasito no estádio larvário intravascular, bem como da regulação de sua expressão de genes quando o mesmo se encontra no sistema porta hepático do hospedeiro, onde as formas adultas são essenciais para desenvolvimento da doença

Aspectos adaptativos de Schistosoma mansoni na fase esquistossômulo: abordagem in vivo e in vitro / Adaptive aspects of Schistosoma mansoni in schistosomulum phase: in vivo and in vitro approach

Dentre as formas evolutivas do Schistosoma mansoni, o esquistossômulo é uma das mais estudadas para desenvolvimento de novos fármacos e sistemas diagnósticos. Embora a transformação in vitro seja vantajosa, é importante discutir as limitações do uso de resultados obtidos a partir de parasitos cultivados in vitro em relação aos obtidos no processo natural de infecção. No presente trabalho, esquistossômulos obtidos in vivo e in vitro foram comparados em relação a capacidade de captar sondas fluorescentes, específicas para estruturas internas celulares ou membranas superficiais do parasito. As sondas empregadas para membranas e estruturas internas mostraram marcação similar entre parasitos obtidos in vitro, por transformação mecânica (Mec) e por penetração em pele (Pel). No entanto, diferenças foram observadas quando estes parasitos foram comparados a outros obtidos in vivo pelo método de Clegg (Clegg et al,1965), sendo detectado um aumento da permeabilidade de membranas...

Os dados sugerem que nos esquistossômulos cultivados in vivo o metabolismo é mais ativo nas células superficiais e que durante sua permanência por até 72 horas na pele há um extenso turnover da superfície do parasito, envolvendo moléculas internas e uma umento da liberação de imunógenos. A aumentada permeabilidade pode permitir ainda a captação de moléculas, capazes de estimular o crescimento do parasito. Além disso, bibliotecas de esquistossômulos Mec cultivados em soro portal (SPO3h eSPO12h) e soro periférico de hamster (SPE3h, SPE12h) foram comparadas utilizando sequenciamento de nova geração (NGS) e análise da expressão de genes específicos. Após o sequenciamento e análise dos genes expressos uma alta similaridade entre as réplicas foi encontrada. Comparando as amostras SPO3h versus SPO12h 58 transcritos se mostraram diferencialmente expressos. De acordo com as anotações de termos de ontologia gênica (GO) os genes diferencialmente expressos após 12 horas de contato com o soro portal de hamster, estão ligados a processos importantes ao desenvolvimento até vermes adultos. Assim, este estudo viabilizou um maior entendimento de mecanismos de controle sobre a internalização de moléculas pelo parasito no estádio larvário intravascular, bem como da regulação de sua expressão de genes quando o mesmo se encontra no sistema porta hepático do hospedeiro, onde as formas adultas são essenciais para desenvolvimento da doença...

Estudo funcional da proteína quinase JNK de Schistosoma mansoniatravés de expressão heteróloga no organismo modelo Caenorhabditis elegans

A identificação e caracterização dos mecanismos e moléculas envolvidos em sinalização celular são essenciais para o entendimento da biologia parasitária do S. mansoni. Proteína quinases desempenham papel chave em vias de sinalização e tem sido propostas como potenciais alvos para o desenvolvimento de novas drogas anti-Schistosoma. Visto que a caracterização funcional em S. mansoni é dificultada por limitações nos métodos de transformação genética deste parasito, o presente estudo propõe o uso de C. elegans como um modelo para a expressão heteróloga de genes de S. mansoni que codificam proteínas quinases. Genes que codificam proteína quinase sem S. mansoni,homólogos aos identificados em C. elegans, foram selecionados pelo nosso grupo a partir do proteoma do parasito através de uma abordagem filogenômica. Inicialmente, foi selecionada a proteína quinase JNK, que participa da via de sinalização das MAP quinases para a realização das análises experimentais. Em C. elegans, a proteína JNK está relacionada ao aumento de longevidade e da resistência aos estresses térmico e oxidativo.

Oligonucleotídeos específicos foram desenhados paraamplificar a região promotora do gene emC. elegansbem como as regiões codificantes(CDS) em ambos os organismos. A região promotora foi amplificada a partir do DNAgenômico extraído deC. elegansadultos. O RNA total foi extraído de esquistossômuloseC. elegansadultos. As CDS foram amplificadas a partir do cDNA sintetizado e osfragmentos de DNA resultantes foram clonados emE. coliDH5α. As construçõesobtidas foram digeridas com enzimas de restrição selecionadas de forma a linearizar ovetor contendo a região promotora e recuperar as CDS. Posteriormente, foramrealizadas subclonagens através da ligação das CDS deC. eleganseS. mansonicom aconstrução contendo a região promotora.C. elegansN2 receberam as construçõesfinais através de microinjeção. Foram obtidas três linhagens que expressam Ce_JNK-1,denominadas N2Ex01[Ce_jnk-1], N2Ex02[Ce_jnk-1]e N2Ex03[Ce_jnk-1]e duaslinhagens expressando Sm_JNK, denominadas N2Ex04[Sm_jnk]e N2Ex05[Sm_jnk].Os níveis de expressão de Sm_JNK e Ce_JNK-1 nas linhagens transgênicas foramavaliados por RT-PCR quantitativo. Apesar do aumento da expressão de JNKobservado nas linhagens transgênicas, não houve aumento na longevidade dasmesmas. Embora esta seja a primeira utilização de expressão heteróloga emC. eleganspara investigar a função de genes deS. mansoni, esta técnica tem sido utilizada comsucesso para nematóides parasitos e pode tornar-se uma abordagem alternativa para osestudos funcionais em outros parasitos

Estudo funcional da proteína quinase JNK de Schistosoma mansoniatravés de expressão heteróloga no organismo modelo Caenorhabditis elegans / Functional studies of the protein kinase JNK Schistosoma mansoni by heterologous expression in the model organism C. elegans

A identificação e caracterização dos mecanismos e moléculas envolvidos em sinalização celular são essenciais para o entendimento da biologia parasitária do S. mansoni. Proteína quinases desempenham papel chave em vias de sinalização e tem sido propostas como potenciais alvos para o desenvolvimento de novas drogas anti-Schistosoma. Visto que a caracterização funcional em S. mansoni é dificultada por limitações nos métodos de transformação genética deste parasito, o presente estudo propõe o uso de C. elegans como um modelo para a expressão heteróloga de genes de S. mansoni que codificam proteínas quinases. Genes que codificam proteína quinase sem S. mansoni,homólogos aos identificados em C. elegans, foram selecionados pelo nosso grupo a partir do proteoma do parasito através de uma abordagem filogenômica. Inicialmente, foi selecionada a proteína quinase JNK, que participa da via de sinalização das MAP quinases para a realização das análises experimentais. Em C. elegans, a proteína JNK está relacionada ao aumento de longevidade e da resistência aos estresses térmico e oxidativo. Oligonucleotídeos específicos foram desenhados paraamplificar a região promotora do gene emC. elegansbem como as regiões codificantes(CDS) em ambos os organismos. A região promotora foi amplificada a partir do DNAgenômico extraído deC. elegansadultos. O RNA total foi extraído de esquistossômuloseC. elegansadultos. As CDS foram amplificadas a partir do cDNA sintetizado e osfragmentos de DNA resultantes foram clonados emE. coliDH5α. As construçõesobtidas foram digeridas com enzimas de restrição selecionadas de forma a linearizar ovetor contendo a região promotora e recuperar as CDS. Posteriormente, foramrealizadas subclonagens através da ligação das CDS deC. eleganseS. mansonicom aconstrução contendo a região promotora.C. elegansN2 receberam as construçõesfinais através de microinjeção. Foram obtidas três linhagens que expressam Ce_JNK-1,denominadas N2Ex01[Ce_jnk-1], N2Ex02[Ce_jnk-1]e N2Ex03[Ce_jnk-1]e duaslinhagens expressando Sm_JNK, denominadas N2Ex04[Sm_jnk]e N2Ex05[Sm_jnk].Os níveis de expressão de Sm_JNK e Ce_JNK-1 nas linhagens transgênicas foramavaliados por RT-PCR quantitativo. Apesar do aumento da expressão de JNKobservado nas linhagens transgênicas, não houve aumento na longevidade dasmesmas. Embora esta seja a primeira utilização de expressão heteróloga emC. eleganspara investigar a função de genes deS. mansoni, esta técnica tem sido utilizada comsucesso para nematóides parasitos e pode tornar-se uma abordagem alternativa para osestudos funcionais em outros parasitos.

Seleção de um painel de antígenos biomarcadores de Schistosoma mansoni através de análises do proteoma sorológico

Apesar do grande esforço na tentativa de controlar a esquistossomose, esta doença continua sendo uma das mais prevalentes no mundo. Novas intervenções são uma prioridade importante para a eliminação da esquistossomose, uma vez que o controle da doença tem sido baseado essencialmente na quimioterapia, a qual não previne a reinfecção. O desenvolvimentode uma vacina para a esquistossomose para proteção a longo prazo, bem como de um novo teste de diagnóstico, constituirá um grande avanço para o controle da doença. A compreensão da resposta imunológica associada com os estados de infecção/proteção pode constituir a base da descoberta de novos antígenos biomarcadores para vacina e diagnóstico para a esquistossomose. Recentes avanços na área pós-genômica têm permitido uma busca mais racional por biomarcadores. Inicialmente, eletroforese bidimensional (2-DE) de extratoproteico total de diferentes fases de desenvolvimento do Schistosoma mansoni foi realizada, obtendo-se um perfil de separação de spots proteicos com boa resolução com os extratos de todas as fases, mas com um perfil distinto entre eles.

Posteriormente, proteínas do extratoproteico de verme adulto, total e de tegumento, foram separaradas por 2-DE e, então, incubadas com amostras de soro de indivíduos infectados (INF) e não infectados de área endêmica (NE) e de indivíduos não infectados de área não endêmica (NI) para esquistossomose em experimento de Western-blotting bidimensional (2D-WB). No total, 47 proteínas imunogênicas foram identificadas por espectrometria de massas. Embora a maioria dos spots proteicos sejam imunogênicos aos diferentes pools de soro, nove spots proteicos reagiram exclusivamente com o pool de soro INF e um com o pool de soro NE. Algumas glicoproteínas foram identificadas no extrato proteico total de verme adulto de S. mansoni usando o método Periodic Acid-Schiff e lectina-blotting. No entanto, o tratamento com periodato/borohidreto indicou que a porção glicídica não tem influência sobre a reatividade das proteínas aos diferentes pools de soro utilizados nos experimentos de 2D-WB. Westernblotting de duas proteínas recombinantes, selecionadas dos experimentos de 2D-WB, mostrou um perfil de reconhecimento pelos diferentes pools de soro semelhante ao das proteínas nativas. Dentre as proteínas imunogênicas identificadas nos experimentos de 2D-WB, 27 foram expressas in vitro com sucesso, as quais serão utilizadas em experimentos futuros em um microarranjo de proteínas. A associação de eletroforese bidimensional e Western-blotting permitiu a seleção de um painel de antígenos proteicos capazes de distinguir os estados de suscetibilidade e resistência à esquistossomose mansônica. Estes antígenos poderão ser utilizados como biomarcadores no desenvolvimento de uma vacina e/ou de um novo teste diagnóstico para a doença.

Seleção de um painel de antígenos biomarcadores de Schistosoma mansoni através de análises do proteoma sorológico / Selection of a panel of biomarkers antigens of Schistosoma mansoni by analysis of serologic proteome

Apesar do grande esforço na tentativa de controlar a esquistossomose, esta doença continua sendo uma das mais prevalentes no mundo. Novas intervenções são uma prioridade importante para a eliminação da esquistossomose, uma vez que o controle da doença tem sido baseado essencialmente na quimioterapia, a qual não previne a reinfecção. O desenvolvimentode uma vacina para a esquistossomose para proteção a longo prazo, bem como de um novo teste de diagnóstico, constituirá um grande avanço para o controle da doença. A compreensão da resposta imunológica associada com os estados de infecção/proteção pode constituir a base da descoberta de novos antígenos biomarcadores para vacina e diagnóstico para a esquistossomose. Recentes avanços na área pós-genômica têm permitido uma busca mais racional por biomarcadores. Inicialmente, eletroforese bidimensional (2-DE) de extratoproteico total de diferentes fases de desenvolvimento do Schistosoma mansoni foi realizada, obtendo-se um perfil de separação de spots proteicos com boa resolução com os extratos de todas as fases, mas com um perfil distinto entre eles...

Despite intensive efforts to wards schistosomiasis control, the disease is still one of the most prevalent in the world. New interventions are a high priority for the elimination ofschistosomiasis, since the disease control has been essentially based on the use of chemotherapy,which doesnot prevent reinfection. The development of a long term protection and an effective diagnostic assay would be a major breakthrough for schistosomiasis control. Understanding which aspects of the immune responses are associated with infection/protections tatus may constitute the basis for the understanding of a successfulvaccine and could also indicate new diagnostic candidates. Progress on post genomic technologies resulted in the development of rational and global approaches for the discovery of new bio markers. Initially, two dimensional electrophoresis (2DE) of different developmental stages protein extracts ofSchistosoma mansoni were conducted.It was obtained a good separation pattern of the spots that was distinguishable in all the stagesevaluated. Subsequently, twodimensional electrophoresed S. mansoniadult worm protein extracts, total and tegumental, were probed with pooled sera of infected (INF),non-infectedindividuals from endemic area (NE) andnon-infected individuals from non-endemic schistosomiasis area (NI) in a two-dimensional Western-blotting experiment (2D-WB). Atotal of 47 immunoreactive proteins were identified by mass spectrometry. Although most of the protein spots were immunoreactive to all of the serum pools, nine reacted exclusively withthe INF serum pool, and one with the NE serum pool. Glycoproteins were identified in the S. mansoni adult worm total protein extract usingPeriodic Acid–Schiff base method and lectin-blotting. However, periodate/borohydride treatment indicated that the glycoprotein glycanportion had no influence on the immunoreaction obtained in the 2D-WB experiments using different serum pools. Western- blotting of ...

T Regulatory Cell Responses to Immunization with a Soluble Egg Antigen in Schistosoma mansoni-Infected Mice

The aim of the study is to characterize the phenotypes of CD4+ CD25+ T regulatory cells within the liver granulomas and association with both Foxp-3 gene expression and splenic cytokines. Naive C57BL/6 mice were intravenously injected with multiple doses of the soluble egg antigen (SEA) 7 days before cercarial infection. The immunized and infected control groups were sacrificed 8 and 16 weeks post-infection (PI). Histopathology, parasitological parameters, splenic phenotypes for T regulatory cells, the FOXP-3 expression in hepatic granuloma using real-time PCR, and the associated splenic cytokines were studied. Histopathological examination of the liver revealed remarkable increase in degenerated ova within hepatic granuloma which decreased in diameter at weeks 8 and 16 PI (P<0.01). The percentage of T regulatory cells (CD4+ CD25+) increased significantly (P<0.01) in the immunized group compared to the infected control at weeks 8 and 16 PI. The FOXP-3 expression in hepatic granulomas increased from 10 at week 8 to 30 fold at week 16 PI in the infected control group. However, its expression in the immunized group showed an increase from 30 at week 8 to 70 fold at week 16 PI. The splenic cytokine levels of pro-inflammatory cytokines, IFN-gamma, IL-4, and TNF-alpha, showed significant decreases (P<0.05) compared to the infected control group. In conclusion, the magnitude and phenotype of the egg-induced effects on T helper responses were found to be controlled by a parallel response within the T regulatory population which provides protection in worm parasite-induced immunopathology.

Inheritance of Schistosoma mansoni infection incompatibility in Biomphalaria alexandrina snails

In this study, we looked at the inheritance of susceptibility and resistance to Schistosoma mansoni infection in the first generation of crossbred Biomphalaria alexandrina snails. Our ultimate goal is to use such information to develop a biological method of controlling schistosomiasis. We infected laboratory-bred snails with S. mansoni miracidia and examined cercarial shedding to determine susceptibility and resistance. Five parental groups were used: Group I contained 30 susceptible snails, Group II contained 30 resistant snails, Group III contained 15 susceptible and 15 resistant snails, Group IV contained 27 susceptible and three resistant snails and Group V contained three susceptible and 27 resistant snails. The percentage of resistant snails in the resulting progeny varied according to the ratio of susceptible and resistant parents per group; they are 7 percent, 100 percent, 68 percent, 45 percent and 97 percent from Groups I, II, III, IV and V, respectively. On increasing the percentage of resistant parent snails, the percentage of resistant progeny increased, while cercarial production in their susceptible progeny decreased.

Identificação e caracterização computacional de proteínas do tipo IUP no proteoma predito de Schistosoma mansoni / Caracterization and identification proteins of computational of the type IUP in predicted proteoma of the Schistosoma mansoni

A relação entre estrutura e função protéica é um dos conceitos mais bem estabelecidos da biologia molecular. O acúmulo de evidências experimentais, cujos primeiros trabalhos datam de 1890, suportam essa hipótese com grande embasamento científico. Apesar da existência de evidências de mais de um século de estudos, somente no inicio da década de 90 começaram a surgir trabalhos mostrando de forma conclusiva a existência de proteínas funcionalmente ativas, mas incapazes de manter uma conformação estável em condições fisiológicas. Tais proteínas, hoje conhecidas como IUPs (do inglês Intrinsically Unstructured Proteins) estão envolvidas em importantes processos de saúde e doenças, tais como o câncer e diversos processos de interação parasito/hospedeiro. A presente dissertação tem como proposta o estabelecimento de um pipeline computacional visando à avaliação dos diferentes algoritmos de predição de desordem estrutural, seu desempenho e a posterior aplicação dessa ferramenta no estudo in silico do conteúdo de IUPs presentes no proteoma predito de Schistosoma mansoni. Complementarmente, foi desenhado um banco de dados MySQL capaz de albergar toda a informação de desordem estrutural juntamente com diferentes dados de caracterização das IUPs para S. mansoni.

Foram analisados um total de 10.417 proteínas, 7.373 predições de desordem estrutural, mais de 24.600 predições de características estruturais e funcionais, desenvolvidos 21 scripts, e todas essas predições e scripts desenvolvidos foram integrados em um pipeline totalmente automático e inédito para. análise de desordem estrutural. Nossas análises de sensibilidade e especificidade implementadas pela análise de gráficos ROC e pela integração de resultados utilizando bancos de dados relacionais indicam que a predição integrativa (consenso de quatro diferentes metodologias de predição) de desordem estrutural apresenta um ganho de 40% na correta identificação de regiões desordenadas se comparada às predições de cada metodologia individualmente. Aproximadamente 5,5% das regiões desordenadas identificadas tiveram suas coordenadas limítrofes ajustadas após comparação com as coordenadas de domínios conservados. Nossos resultados indicam que aproximadamente 33,6% do proteoma predito de S. mansoni apresenta desordem estrutural. Destas, 2% apresentam domínios transmembrana e 7% apresentam peptídeo sinal. A comparação do perfil funcional das IUPs com as proteínas globulares de S. mansoni demonstra uma maior proporção de IUPs envolvidas em processos de regulação celular e componentes extracelulares.

Identificação e caracterização computacional de proteínas do tipo IUP no proteoma predito de Schistosoma mansoni

A relação entre estrutura e função protéica é um dos conceitos mais bem estabelecidos da biologia molecular. O acúmulo de evidências experimentais, cujos primeiros trabalhos datam de 1890, suportam essa hipótese com grande embasamento científico. Apesar da existência de evidências de mais de um século de estudos, somente no inicio da década de 90 começaram a surgir trabalhos mostrando de forma conclusiva a existência de proteínas funcionalmente ativas, mas incapazes de manter uma conformação estável em condições fisiológicas. Tais proteínas, hoje conhecidas como IUPs (do inglês Intrinsically Unstructured Proteins) estão envolvidas em importantes processos de saúde e doenças, tais como o câncer e diversos processos de interação parasito/hospedeiro. A presente dissertação tem como proposta o estabelecimento de um pipeline computacional visando à avaliação dos diferentes algoritmos de predição de desordem estrutural, seu desempenho e a posterior aplicação dessa ferramenta no estudo in silico do conteúdo de IUPs presentes no proteoma predito de Schistosoma mansoni. Complementarmente, foi desenhado um banco de dados MySQL capaz de albergar toda a informação de desordem estrutural juntamente com diferentes dados de caracterização das IUPs para S. mansoni.

Foram analisados um total de 10.417 proteínas, 7.373 predições de desordem estrutural, mais de 24.600 predições de características estruturais e funcionais, desenvolvidos 21 scripts, e todas essas predições e scripts desenvolvidos foram integrados em um pipeline totalmente automático e inédito para. análise de desordem estrutural. Nossas análises de sensibilidade e especificidade implementadas pela análise de gráficos ROC e pela integração de resultados utilizando bancos de dados relacionais indicam que a predição integrativa (consenso de quatro diferentes metodologias de predição) de desordem estrutural apresenta um ganho de 40% na correta identificação de regiões desordenadas se comparada às predições de cada metodologia individualmente. Aproximadamente 5,5% das regiões desordenadas identificadas tiveram suas coordenadas limítrofes ajustadas após comparação com as coordenadas de domínios conservados. Nossos resultados indicam que aproximadamente 33,6% do proteoma predito de S. mansoni apresenta desordem estrutural. Destas, 2% apresentam domínios transmembrana e 7% apresentam peptídeo sinal. A comparação do perfil funcional das IUPs com as proteínas globulares de S. mansoni demonstra uma maior proporção de IUPs envolvidas em processos de regulação celular e componentes extracelulares.

Mapeamento dos domínios antigênicos compartilhados entre a apirase de batata e as isoformas de ATP difosfohidrolase de Schistosoma mansoni / Mapping of the conserved antigenic domains shared between potato apyrase and ATP diphosphohydrolase isoforms from Schistosoma mansoni

Usando a apirase de batata como antígeno, as propriedades imunogênicas das isoformas de ATP difosfohidrolase de S. mansoni foram inicialmente exploradas em esquistossomose experimental. Elevada reatividade de anticorpos IgG2a e IgG1 contra esta proteína vegetal foi observada em soro de camundongos BALB/c na fase aguda da infecção (8-9ª semana pós-infecção). Elevada reatividade de anticorpos IgG1 com a apirase de batata, mas não de IgG2a, foi encontrada na fase crônica da infecção (17ª semana pós-infecção), diferenciando sorologicamente as fases da infecção. Adicionalmente, foi observado que o inóculo de apirase de batata em camundongos BALB/c saudáveis tem marcante atividade estimulatória, aumentando significativamente os níveis de anticorpos IgG1 e IgG2a específicos. O subtipo IgG1 de camundongo, mas não IgG2a, reage com a ATP difosfohidrolase presente na preparação de SEA. A reatividade de anticorpos contra a apirase de batata foi monitorada por um período de 11 meses em camundongos BALB/c tratados com oxaminiquina na fase crônica da doença.

A reatividade de IgM, IgG total ou IgG1 contra a apirase de batata reduziu significativamente (~60%) após 11 meses, enquanto IgG2a, que esteve elevada na fase aguda, perde a significância na fase crônica e permanece inalterada na etapa do pós tratamento. Após a quimioterapia, os camundongos foram re-infectados com 100 cercárias, e nenhuma diferença significativa foi observada na soropositividade de IgG1, mas uma elevação significativa de IgG2a foi detectada nos camundongos re-infectados sugerindo uma nova fase aguda e sua participação nos mecanismos de proteção contra o Schistosoma. Estudos in silico demonstraram uma íntima relação estrutural e evolucionária entre a apirase de batata e as isoformas de ATP difosfohidrolases de S. mansoni. A predição de modelos tridimensionais sugeriu que os domínios conservados podem estar expostos e disponíveis para a ligação com anticorpos. O perfil de reatividade de anticorpos contra a apirase de batata foi, então, estudado em amostras de soros obtidas de pacientes com esquistossomose, moradores de três áreas endêmicas diferentes. Amostras de soros de grupos de adultos e crianças mostraram alta reatividade contra a apirase de batata, com elevação dos níveis de anticorpos IgA, IgE, IgG1 ou IgG4, com diferenças significativas entre eles. Após a quimioterapia, redução significativa ou ausência de reatividade de anticorpos contra a apirase de batata foi observada nestes pacientes. Esses achados podem estar associados à resistência ou susceptibilidade

Mapeamento dos domínios antigênicos compartilhados entre a apirase de batata e as isoformas de ATP difosfohidrolase de Schistosoma mansoni

Usando a apirase de batata como antígeno, as propriedades imunogênicas das isoformas de ATP difosfohidrolase de S. mansoni foram inicialmente exploradas em esquistossomose experimental. Elevada reatividade de anticorpos IgG2a e IgG1 contra esta proteína vegetal foi observada em soro de camundongos BALB/c na fase aguda da infecção (8-9ª semana pós-infecção). Elevada reatividade de anticorpos IgG1 com a apirase de batata, mas não de IgG2a, foi encontrada na fase crônica da infecção (17ª semana pós-infecção), diferenciando sorologicamente as fases da infecção. Adicionalmente, foi observado que o inóculo de apirase de batata em camundongos BALB/c saudáveis tem marcante atividade estimulatória, aumentando significativamente os níveis de anticorpos IgG1 e IgG2a específicos. O subtipo IgG1 de camundongo, mas não IgG2a, reage com a ATP difosfohidrolase presente na preparação de SEA. A reatividade de anticorpos contra a apirase de batata foi monitorada por um período de 11 meses em camundongos BALB/c tratados com oxaminiquina na fase crônica da doença.

A reatividade de IgM, IgG total ou IgG1 contra a apirase de batata reduziu significativamente (~60%) após 11 meses, enquanto IgG2a, que esteve elevada na fase aguda, perde a significância na fase crônica e permanece inalterada na etapa do pós tratamento. Após a quimioterapia, os camundongos foram re-infectados com 100 cercárias, e nenhuma diferença significativa foi observada na soropositividade de IgG1, mas uma elevação significativa de IgG2a foi detectada nos camundongos re-infectados sugerindo uma nova fase aguda e sua participação nos mecanismos de proteção contra o Schistosoma. Estudos in silico demonstraram uma íntima relação estrutural e evolucionária entre a apirase de batata e as isoformas de ATP difosfohidrolases de S. mansoni. A predição de modelos tridimensionais sugeriu que os domínios conservados podem estar expostos e disponíveis para a ligação com anticorpos. O perfil de reatividade de anticorpos contra a apirase de batata foi, então, estudado em amostras de soros obtidas de pacientes com esquistossomose, moradores de três áreas endêmicas diferentes. Amostras de soros de grupos de adultos e crianças mostraram alta reatividade contra a apirase de batata, com elevação dos níveis de anticorpos IgA, IgE, IgG1 ou IgG4, com diferenças significativas entre eles. Após a quimioterapia, redução significativa ou ausência de reatividade de anticorpos contra a apirase de batata foi observada nestes pacientes. Esses achados podem estar associados à resistência ou susceptibilidade

Caracterização de proteínas MAPKs e MKPs no Genoma de Schistosoma mansoni: uma abordagem in silico e experimental

Pouco se sabe a respeito dos mecanismos de transdução de sinal no parasito Schistosoma mansoni. A identificação e caracterização dos mecanismos e das moléculas envolvidas em vias de transdução de sinal são essenciais para se entender a biologia do parasito e interações hospedeiro-parasito. As proteínas MAPK (Mitogen-activated protein kinases) desempenham um importante papel na transdução de sinais extracelulares, controlando vários mecanismos celulares essências. As MKPs são o principal grupo de proteína fosfatases que controlam a magnitude e a duração da ativação das proteínas MAPK. Até o presente momento, nenhuma proteína da família das MAPKs ou proteínas MKPs havia sido detalhadamente caracterizada no parasito S. mansoni. Foi realizada uma análise in silico. abragente da versão 3.1 do genoma de S. mansoni utilizando diferentes abordagens de bioinformática, incluindo buscas por similaridade de seqüências realizadas com o algoritmo blast ou com modelos ocultos de Markov (HMM) especificamente elaborados e construídos para identificação de MAPKs e MKPs. Complementarmente foi realizada a anotação manual dos genes que apresentaram hits positivos para proteínas MAPK e MKP utilizando o programa Artemis para integrar as anotações.

Com base nesses resultados quatro proteínas foram selecionadas para posterior validação experimental: uma proteína ERK (SmMAPK1), uma proteína JNK (SmMAPK2) e duas proteínas fosfatase de dupla especificidade (SmMKP1e SmMKP2). Análises in silico revelaram ainda que os aminoácidos importantes para a funcionalidade das proteínas estão conservados. Nas MAPKs os resíduos dos domínios CD e ED, essenciais para o reconhecimento dos ativadores, substratos e desativadores, estão conservados. Nas fosfatases, o sítio de ligação as MAPKs está presente e apresenta os aminoácidos essenciais para a interação entre as proteínas. O cDNA de SmMAPK1, SmMAPK2, SmMKP1 e SmMKP2 está presente em todas as fases de desenvolvimento do parasito. E, em SmMKP1 observamos grande quantidade de transcrito em miracídio e também a presença de ortólogos a SmMKP1 em diversas espécies do gênero Schistosoma. As proteínas foram expressas em fusão a GST utilizando vetor de expressão pGEX. O teste de solubilidade mostrou que SmMAPK1, SmMKP1 e SmMKP2 estão presente na fase insolúvel, provavelmente em corpos de inclusão. Esse trabalho enfatiza a importância de se integrar projetos de sequenciamento do genoma, predição de proteínas, anotação manual dos genes e validação experimental para a identificação de proteínas alvo para o desenvolvimento de novas drogas

Caracterização genética de populações de campo de Schistosoma mansoni com o uso de microssatélites / Genetic characterization of field populations of Schistosoma mansoni by using microsatellite

Apresentamos a utilização de 4 bibliotecas genômicas enriquecidas, como fonte de microssatélites, para o estudo da estrutura genética de populações de Schistosoma mansoni. De 382 seqüências obtidas, 250 (65,4%) apresentaram loci de microssatélites. Onze destes loci foram polimórficos quando testados em 100 vermes, com 2 a 19 alelos por loci. A heterozigosidade esperada (He) foi de 0,79 e a observada (Ho) de 0,59. Apresentamos ainda um locus de minissatélites, com uma porção interna variável composta por um microssatélite “CA”. Este minissatélite e outros 3 loci de microssatélites, anteriormente descritos, mostraram sucesso na diferenciação de cepas de S. mansoni e de 9 diferentes espécies do gênero Schistosoma. Apresentamos também, a utilização de ovos individualizados de S. mansoni como fonte de DNA para PCR, um novo protocolo, que utiliza resina de troca iônica, para extração do DNA e a utilização de PCR-multiplex na genotipagem de ovos e vermes adultos de S. mansoni. O número de alelos por locus não diferiu entre ovos e vermes e observamos ainda uma redução no número de genótipos homozigotos nos vermes, em relação aos ovos. Tanto os ovos quanto os vermes utilizados foram provenientes das amostras de fezes coletadas de moradores da área endêmica de Virgem das Graças – Minas Gerais. Analisamos ainda, entre 10 e 22 ovos, de outras 53 populações de parasitos, da mesma área, para a determinação de sua variabilidade genética.

Para se testar uma possível estruturação geográfica destas populações, estas foram divididas em 5 grupos, de acordo com sua origem geográfica dentro do município. Destas populações, 33 foram coletadas de amostras de fezes pré-tratamento e 20, pós-tratamento quimioterápico. Nove populações coletados antes e depois do tratamento foram comparadas para o estudo da influência da quimioterapia sobre variabilidade genética. Foram utilizados nestas análises 5 loci de microssatélites por apresentarem resultados consistentes com DNA de ovos e em PCR-multiplex. Entre as 53 populações observamos que o número de alelos por locus variou de 2 a 13 e não houve correlação entre variações no número de alelos por locus e o tratamento. A heterozigozidade observada variou de 0,0 a 1,0. Com exceção de 13 populações, Ho foi sempre menor que He. Em 39 das 53 populações, em pelo menos um locus, Ho foi significativamente diferente de He (p<0,05) representando desvios do equilíbrio de Hardy-Weinberg. Não se observou nenhum tipo de estruturação geográfica destas populações quando comparadas par a par, em uma ou ambas as coletas, ou quando comparadas pré e pós-tratamento quimioterápico. Este trabalho abre perspectivas promissoras no estudo e no entendimento de vários mecanismos biológicos envolvidos nas interações parasito-hospedeiro, na patogenia e epidemiologia e até numa futura quimioterapia da esquistossomose, doença que ainda hoje afeta, de maneira séria, e em certos casos, fatal, cerca de 200 milhões de pessoas em mais de 70 paises.

Caracterização genética de populações de campo de Schistosoma mansoni com o uso de microssatélites

Apresentamos a utilização de 4 bibliotecas genômicas enriquecidas, como fonte de microssatélites, para o estudo da estrutura genética de populações de Schistosoma mansoni. De 382 seqüências obtidas, 250 (65,4%) apresentaram loci de microssatélites. Onze destes loci foram polimórficos quando testados em 100 vermes, com 2 a 19 alelos por loci. A heterozigosidade esperada (He) foi de 0,79 e a observada (Ho) de 0,59. Apresentamos ainda um locus de minissatélites, com uma porção interna variável composta por um microssatélite “CA”. Este minissatélite e outros 3 loci de microssatélites, anteriormente descritos, mostraram sucesso na diferenciação de cepas de S. mansoni e de 9 diferentes espécies do gênero Schistosoma. Apresentamos também, a utilização de ovos individualizados de S. mansoni como fonte de DNA para PCR, um novo protocolo, que utiliza resina de troca iônica, para extração do DNA e a utilização de PCR-multiplex na genotipagem de ovos e vermes adultos de S. mansoni. O número de alelos por locus não diferiu entre ovos e vermes e observamos ainda uma redução no número de genótipos homozigotos nos vermes, em relação aos ovos. Tanto os ovos quanto os vermes utilizados foram provenientes das amostras de fezes coletadas de moradores da área endêmica de Virgem das Graças – Minas Gerais. Analisamos ainda, entre 10 e 22 ovos, de outras 53 populações de parasitos, da mesma área, para a determinação de sua variabilidade genética.

Para se testar uma possível estruturação geográfica destas populações, estas foram divididas em 5 grupos, de acordo com sua origem geográfica dentro do município. Destas populações, 33 foram coletadas de amostras de fezes pré-tratamento e 20, pós-tratamento quimioterápico. Nove populações coletados antes e depois do tratamento foram comparadas para o estudo da influência da quimioterapia sobre variabilidade genética. Foram utilizados nestas análises 5 loci de microssatélites por apresentarem resultados consistentes com DNA de ovos e em PCR-multiplex. Entre as 53 populações observamos que o número de alelos por locus variou de 2 a 13 e não houve correlação entre variações no número de alelos por locus e o tratamento. A heterozigozidade observada variou de 0,0 a 1,0. Com exceção de 13 populações, Ho foi sempre menor que He. Em 39 das 53 populações, em pelo menos um locus, Ho foi significativamente diferente de He (p<0,05) representando desvios do equilíbrio de Hardy-Weinberg. Não se observou nenhum tipo de estruturação geográfica destas populações quando comparadas par a par, em uma ou ambas as coletas, ou quando comparadas pré e pós-tratamento quimioterápico. Este trabalho abre perspectivas promissoras no estudo e no entendimento de vários mecanismos biológicos envolvidos nas interações parasito-hospedeiro, na patogenia e epidemiologia e até numa futura quimioterapia da esquistossomose, doença que ainda hoje afeta, de maneira séria, e em certos casos, fatal, cerca de 200 milhões de pessoas em mais de 70 paises.

Genetic epidemiology of fecal egg excretion during Schistosoma mansoni infection in an endemic area in Minas Gerais, Brazil

There is considerable variation in the level of fecal egg excretion during Schistosoma mansoni infections. Within a single endemic area, the distribution of egg counts is typically overdispersed, with the majority of eggs excreted coming from a minority of residents. The purpose of this study was to quantify the influence of genetic factors on patterns of fecal egg excretion in a rural study sample in Brazil. Individual fecal egg excretions, expressed in eggs per gram of feces, were determined by the Kato-Katz method on stool samples collected on three different days. Detailed genealogic information was gathered at the time of sampling, which allowed assignment of 461 individuals to 14 pedigrees containing between 3 and 422 individuals. Using a maximum likelihood variance decomposition approach, we performed quantitative genetic analyses to determine if genetic factors could partially account for the observed pattern of fecal egg excretion. The quantitative genetic analysis indicated that between 21-37 percent of the variation in S. mansoni egg counts was attributable to additive genetic factors and that shared environment, as assessed by common household, accounted for a further 12-21 percent of the observed variation. A maximum likelihood heritability (h²) estimate of 0.44 ± 0.14 (mean ± SE) was found for the 9,604 second- and higher-degree pairwise relationships in the study sample, which is consistent with the upper limit (37 percent) of the genetic factor determined in the variance decomposition analysis. These analyses point to the significant influence of additive host genes on the pattern of S. mansoni fecal egg excretion in this endemic area